文献信息
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EST2023,Dittmar老师→此领域的大牛"，注：本文整理供本人自己学习
摘要确定溶解有机物(DOM)分子组成的驱动因素对于了解全球碳循环至关重要。然而，由于影响DOM组成的因素混杂，对观察到的模式进行明确的解释是具有挑战性的。在本文献中，Kida等人通过超高分辨率质谱法和核磁共振波谱法等对于南极洲东部的43个湖泊中DOM的组成进行了探索。研究结果表明，不同湖泊中DOM分子组成差异显著，这些湖泊与陆地输入和人类影响隔绝。这些湖泊中DOM的组成主要受光降解程度、硫化程度和pH值差异的影响。DOM的分子β多样性显著，与河流与深海DOM的差异相当，后者主要受环境差异而非空间距离的影响。该研究强调了即使在地球上最原始和有机质来源有限的环境中，DOM的广泛分子多样性也可能出现，同时DOM的组成可以通过环境变量和湖泊的生态历史来预测，研究结果有助于进一步理解DOM随时间推移的分子演替以及组成的特异性等。
关键词 碳循环，DOM，淡水，质谱，核磁共振，光降解
Q1.硫化程度是怎么确定的，什么指标？Q2.分子β多样性显著是用什么方法确定的？
主要内容
（1）DOM含有的碳比全球海洋和陆地生物量的总和还要多，这一巨大DOM库的生产和消费过程对于水生生物地球化学循环和食物网至关重要，因为DOM不仅含有碳，还含有生命其他所必需元素。DOM分子组成在维持其水生系统的长期持久性中起着重要作用，因此，影响水生DOM组成的因素是近年来研究的热点，揭示了水文过程和气候因素等环境变量往往是主要驱动因素。 DOM一个重要特性是高度的分子多样性，这回阻碍的微生物的周转，DOM库由无数浓度极低的不同分子组成，其中大多数分子的化学结构未知。DOM中的个别成分可能因为浓度太低不能补偿其代谢消耗的利用成本，也无法让特定的底物分子和能够利用他们的微生物相遇。除了对DOM持久性的影响，DOM的分子多样性还具有更广泛但的生物地球化学意义，例如影响微生物多样习惯，它们可能共同影响生态系统的功能（衔接的好好）。然而，因为缺乏传统地球化学对分子多样性的关注，关于自然环境中分子多样性的进化以及环境因素如何塑造这种多样性的的只是有限，只有少数实验室培养的实验提供了这一领域的见解。 环境中众多的来源和反应交织在一起导致解释这一动态模式既具有挑战。最小化混杂因素的一种方法是在这些因素有限的情况下利用简化的环境设置。作者所选取的研究地点，在相同的条件下在只有有限的直接人类影响的情况下，是研究不同水化学性质的微生物来源的DOM产生和转化的极好天然培养场景。过去人们人为南极湖泊中DOM bulk整体上的化学特征是相似，因为来源简单。然而，最近在soya coast附近的47个湖泊中进行的研究解释了DOM光学活性部分的组成具有相当大的变异性。因此，尽管有机物来源简单，但不代表这些南极湖泊中的DOM是否表现出高度的分子多样性，需要确定。 在此项研究中，作者旨在探究位于地球上最原始和有机物来源有限的环境之一的湖泊分子多样性的演变情况，并确定其驱动因素。进一步测试了DOMβ多样性是否随着空间距离或环境的不同而增加。假设空间距离和环境差异都是DOMβ多样性的驱动因素，类似于生态学观察，光降解在作为长期水停留时间的SOYA附近湖泊形成微生物产生DOM的分子多样性中起着重要作用。
（2） 结果南极湖DOM的分子性质：α-多样性湖泊的EC范围非常广泛，从淡水到高盐水（>22 S m–1）（图S1）。湖泊的pH值一般为中性至略微碱性，值范围为至。我们观察到EC的DOC呈指数增加（范围从到146 mg C L–1），表明随着EC的增加，湖泊中的原位净产量和蒸发浓度增加（图S1）。在高盐度海洋遗迹湖泊（图1中的第3组和第4组）中，我们保守地估计最多只有%的DOC可能是遗留海洋DOC，因为遗留DOM在自这些湖泊形成以来的数年大约7000年内没有分解。因此，我们排除了遗留海洋DOM在所有研究湖泊中的贡献。非常低的分子降解指数 (IDeg) 为 ± ，也支持这些湖泊中的DOM相对年轻的结论。我们通过FT-ICR MS在SPE-DOM中总共鉴定了9910个独特的MF。分子丰富度DR，或每个样本中的MF数量从2121到6338不等（图2）。每个样品的VK图（O/C与H/C图）在图S2中提供。MF数量的减少与较高的pH和EC有关（图2）。当考虑协变变量时，pH、EC 和湖泊表面积都是 DR 的重要预测因子（图S3）。在冰期湖泊的SPE-DOM样品中，往往检测到更多的MF，其中新鲜产生的微生物衍生的生物分子占主导地位。pH值增加约两个单位对DR有相当大的影响，使其降低一半（从大约6000到3000，图2）。考虑其他变量时，EC同样降低了DR（图2）。基于丰度的多样性 DA 同样随着 pH 值和 EC 的增加而降低，并且 pH 值、EC、湖面面积和海拔高度是重要的预测因子（图S3）。全系列功能多样性DF也随着EC和pH值的增加而明显降低（图2、S4和S5）。
β-多样性的驱动因素我们使用Mantel测试了空间距离或环境差异是否可以各自解释SPE-DOM β多样性。SPE-DOM β-多样性，计算为9910个归一化FT-ICR MS峰强度的Bray-Curtis差异性，范围在到之间（图3）。通过β回归确定了特别负责观察到的SPE-DOM β多样性的环境变量（图S6）并用于计算整体环境差异。我们发现，在我们观察到的尺度上，空间距离并不是SPE-DOM多样性的驱动因素（图3）。相比之下，环境差异（以标准化（z评分）环境变量的欧几里得距离计算）是β多样性的重要影响因素（图3）。选择EC，水温，pH和DIN浓度的差异性都显着影响SPE-DOM β多样性（图S6）
基于DOM分子性质的湖泊分组作者通过层次聚类分析确定了如何分组即分组的个数！Ⅰ 样本之间的分子差异通过基于Jensen-Shannon散度 (JSd) 的非度量多维尺度 (NMDS) 在二维空间中表示，该散度比较了称为DBEAI的分子指数的频率分布（参见材料和方法部分）（图S7）。层次聚类表明，根据JSd，将样本分为四组是最合适的（图S8和S9）。样品的空间分布如图1所示。第一个集群 (CL1) 存在于所有区域，包括所有冰川湖泊，其特征是湖泊和集水区较小，蒸发浓度水平较低（如较低的EC、a254、DOC、DIN和DON)，以及相对丰度较高的类腐殖质成分和芳香性（通过测量类腐殖质荧光成分C500和SUVA254）（图S7）。第二个集群（CL2）包含高盐湖以外的湖泊，主要分布在Skarvsnes，也存在于其他地区（图1）。第三和第四簇（CL3和CL4）由Skarvsnes的两个高盐湖（每个两个深度）组成，与较大的湖泊和集水区有关，光降解程度较高（如较高的S275–295），以及表明蒸发量更大的定量参数值升高（图S7）。环境变量的事后拟合表明，pH值是唯一明确区分CL1和CL2的特征（图S7）。因此，FT-ICR MS检测到CL1和CL2之间的SPE-DOM组成差异，这些差异通过其他水化学特性和体积DOM特性不容易辨别。
Ⅱ我们使用生态学中常用的IndVal指数确定了与每个集群特别相关的关键MF（图4）。表S2提供了根据每个集群的IndVal值选择作为每个集群指标的MF的摘要。没有含P的MF作为指标出现。第一个簇CL1（前冰湖）与贫氧（O/C < ）、高度不饱和（AImod ≤ 和H/C < ）、芳香族（AImod > ）富氮和无S的MFs有关。第二个簇CL2仅与无杂原子，高度不饱和的MF相关。第三个簇CL3（高盐湖Suribachi）富含不饱和（H/C≥）和高度不饱和/芳香MFs。CL3中的高不饱和/芳香族MFs几乎都含有一个S，而不饱和MFs不含杂原子。第四簇CL4（高盐湖船佐湖）富含不饱和MFs。CL4的许多不饱和MF含有可变数量的N和S。图S10提供了每个簇的指示物种的含S或N的MFs的相对丰度，而质量分布，AImod和DBEAI如图S11所示。每个簇的指标 MF 表现出不同的质量和 AImod 分布，尽管后者的差异是预期的，因为用于计算 JSd 的分子指数是 AImod 的分子。质量分布遵循CL2 ∼ CL4> CL1 ∼ CL3，而AIMOD分布明显为CL1>CL2>CL3>CL4（图S11）。MF指标的这些特征与冰川和高盐湖的范克雷维伦图一致（图S12）。仅在冰期湖泊中检测到的MFs主要是O贫乏、高度不饱和和至少具有12个N的芳香MFs，而在高盐湖的地表水中独特的MFs是富含S的不饱和MFs和一些富含S的高度不饱和/芳香MFs（图S4）。使用条件推理树（CTree），确定了最能解释聚类的环境变量（图4）。CL3首先被高EC分离，CL1被水温分离。CL2和CL4通过pH区分（图4）。
这个层次聚类分析还挺复杂哈
Ⅲ我们对全部湖泊进行了1H NMR 数据的主成分分析（PCA），以确定FT-ICR MS数据上的NMDS数据（图S7）是否充分捕获了批量DOM的组成差异。我们确认两个受戒结果的关键特征相似；CL1和CL2在排序空间上分离良好，在样品分布云的边缘绘制了冰川湖和超盐湖（图S13）。具有代表性的DOM NMR波谱如图S13所示。主成分1（PC1）根据DOM的微生物处理程度来区分样品，其中处理的DOM较多，信号较宽位于PC1的正端，而更“新鲜”，处理较少的DOM，具有来自小生物分子的尖锐信号位于PC1的负端（图S13）。PC2根据碳水化合物H的相对丰度分离样品，富含碳水化合物的DOM与阳性PC2相关，而富含脂肪族或功能化的富含脂肪族的DOM与阴性PC2相关（图S13）。水的pH值仍然是CL1和CL2与海拔高度之间的区别因素。DOC、DON和a254等定量参数再次未能解释这两个簇之间的差异。
讨论
（1）DOM α-多样性的驱动因素：光降解和pH变化在研究的南极湖泊中，EC和pH分别降低了所有三种类型的SPE-DOM α多样性（图2，S4和S5）。这是令人惊讶的，因为其他环境变量，如水温和营养物质（DIN，PO43–和 SiO32–），可能强烈影响微生物活性的参数与这些参数不协调。这些湖泊的蒸发浓缩过程以不同的速率发生，反映了干旱条件下的普遍蒸发与集水区冰雪的淡水输入之间的平衡。通常，较高的EC值表示净淡水增益较低，因此保水时间较长。这种较长的保水时间反过来又导致DOM的光降解，如光谱斜率（S275–295）、光降解指数和EC。我们承认需要谨慎使用S275–295作为光降解指数，因为它也与有机物来源和分子量的差异有关。然而，对于这个特定的数据集，我们先前的研究已经证明了它作为光降解指数的适用性，部分原因是来源的简单性和一定程度的光降解中明显的环境梯度。光降解程度的增加（S275–295）和DOM光学活性部分的芳香族代理（图S7）。显然，由于较长的保水时间，DOM的光降解增强选择性地减少了吸光，芳香族和/或含杂原子的化合物（图S12），它没有减少大量DOC（图S1）。某些化合物的选择性降解降低了DR，导致化合物的丰度分布不太均匀和DA减少（图2），同时它还降低了关于芳香性（H/C、AImod和DBE）的DF（图2和S4）。DF的范围与一项为期3年的培养研究中的SPE-DOM数据更加接近，该研究中使用了人工海水接种了北海沿海水域的微生物群落，而不是大西洋和南极海域的野外观测，后者估计DOM的年龄为数千年，这表明南极湖泊中的DOM处于降解级联的初始阶段。
SPE-DOM α多样性随着pH值的增加而降低（图2）可能是由非生物因素引起的。所研究湖泊的弱碱性 pH 值是由于基岩成分主要是辉石或石榴石-黑云母片麻岩。这种基岩的风化释放出Ca和Mg，导致湖水pH值增加。然而，pH值的变化与其他水成分、湖泊形态或基岩组成（辉石与石榴石-黑云母片麻岩）无关，可能反映了湖泊中基岩的风化程度。高pH值会导致氧化程度最高的DOM化合物与铁和铝氢氧化物共沉淀，从而减少α-多样性的集合。此外，pH值的增加可以提高DOM的光降解效率，因为羧基和酚基的去质子化和/或构象变化，并且可能通过增强光降解导致α多样性随着pH值的增加而降低。
（2） DOM β-多样性的驱动因素：空间距离与环境差异 令人惊讶的是，有机物源有限的南极湖泊在SPE-DOM分子组成方面非常不同（Bray-Curtis差异范围为至，平均值为±，图3）。相比之下，从热带到北极的十条世界上最大的河流彼此之间的SPE-DOM在分子上更加相似（±）。一些湖泊之间的SPE-DOM甚至显示出与河流和深海之间观察到的差异一样大的差异（图3）。在相同气候下，位于空间有限区域内的湖泊中如何出现如此大的β多样性？为了解决这个问题，我们首先测试了空间距离与SPE-DOM β多样性相关的假设。然而，我们观察到相反的情况；在我们研究的空间尺度上，空间距离对SPE-DOM β多样性没有影响。具体来说，来自彼此靠近的湖泊的SPE-DOM与来自远处湖泊的SPE-DOM在分子上并不相似（图3）。这一发现与理论生态学中的范式相反，该范式认为群落组成相似性预计会随着距离而降低，反驳我们的第一个假设。SPE-DOM β多样性与距离之间缺乏显著关系表明，SPE-DOM的β多样性可能由不随距离变化的小规模环境异质性驱动。这与大多数湖泊在水文上是脱节的并且已经发展了数千年这一事实是一致的。在由周围环境（如湖泊形态、地质、小气候和集水区内的生物活动）随机决定的湖泊特定设置下。因此，我们发现环境差异（pH、EC、温度和 DIN）与 SPE-DOM 分子多样性 (rM = ) 之间存在显着且强烈的相关性（图3）。虽然居住在湖泊中的微生物可能在塑造SPE-DOM多样性方面发挥重要作用，就像它们在其他水生环境中一样，我们缺乏微生物数据来测试这一点。然而，由于微生物组成和功能在很大程度上是由环境驱动的，环境差异将成为所研究湖泊中SPE-DOM分子多样性的强大驱动力。 EC的差异性是影响SPE-DOM β多样性的最重要参数（图S6）。SPE-DOM组成在不同程度的蒸散浓度和光降解下可能出现湖泊差异。水温（采样时）是影响第二大的参数（图S6）。水温可能通过微生物活动的变化间接影响SPE-DOM组成，但在我们的数据集中，这更可能是由于高盐湖的特殊水温（苏里巴奇湖为12-21°C，富纳佐科湖为-至20°C）。以及这些湖泊中不同的DOM分子组成（图4和S7）。高盐度海洋遗迹湖泊中的 SPE-DOM 含有高丰度的 S，这可能是由于在水层化引起的缺氧条件下硫化物对 DOM 的非生物硫化作用（图4和S10）。即使在高盐湖的地表水中，S的相对丰度也很高，这表明尽管这些湖泊中存在广泛的光降解，但仍有含S的DOM（DOS）的净产量。最近提出的DOS的难降解性可能有助于DOM在高盐湖中的大量积累。在高盐水湖泊中也观察到高DIN值，使其成为SPE-DOM β多样性的明显驱动因素（图S6）。水的pH值也对SPE-DOM β多样性有影响（图S6）。在冰期湖泊中观察到较低的pH值，其中SPE-DOM特别富含N（图4，S10和S12）。冰期湖泊SPE-DOM中氮的富集与先前的发现一致，即Sôya海岸冰川融水中的DOM富含不稳定的含氮化合物。冰期湖泊中氮的相对富集表明，尽管本研究中的所有样品主要来自微生物，但根据DOM的“新鲜度”，样品之间的相对氮丰度可能会有所不同。这些含N的不稳定化合物可能在冰川融化后被异养细菌和其他小生物分子迅速消耗，导致产生更复杂的DOM并增强DOM分子多样性。 总之，我们表明SPE-DOM的α和β多样性都可以仅基于几个主要水化学参数来预测（图2和S3-S6）。此外，我们的结果表明，随着保水时间的增加和α多样性随着EC升高而降低，SPE-DOM的组成在单个湖泊中变得更加独特，而β多样性随着EC差异的增加而增加（即，冰川湖和高盐湖在SPE-DOM组成方面表现出最大的差异）（图2和S3-S6）。DOM随时间推移的分子演替以及由此产生的DOM组成的特异性是湖泊生态历史的极好代表。
研究方法
分子α和β多样性：所有统计分析均使用R语言。
Ⅰ作为分子α多样性的指标，计算了分子丰富度DR、基于丰度的Gini——Simpson指数（Simpson index of diversity）DA和根据Mentges等人通过FT-ICR MS分析的功能分子多样性DF。①分子丰富度DR被定义为FTICR MS在样本中鉴定的MF的数量。DR是DOM分子α多样性的简单度量，但是同一样本的重复测量可能有很大差异。②DA是使用相对峰度强度分布，该值可以解释为两个随机选择的分子的MFs不同的概率。该指数的范围在0到1之间，其中较大的值表示较高的多样性。③DF功能多样性指标应用于FT-ICR MS数据计算为距离函数（Rao二次熵），使用任何两个MF之间相对于给定化学性质的绝对差值，并按其相对峰值强度加权。DF的值可以解释为两个分子之间相对于所选性质的预期差异。
在这项研究中，计算功能多样性与C原子数作为分子量指标，H/C最为饱和度指标，N/C作为相对氮丰富度的指标，AImod和DBE最为DOM芳香性的指标，碳的标称氧化态NOSC最为与化合物反应性相关的MF平均氧化态的指标。随着NOSC的增加，有机化合物的氧化在热力学上变得更加有利可图。
Ⅱ分子β多样性计算：Jensen-Shannon差异 (JSd) 是遗传学和信息论中使用的一种差异，用于计算样本之间的分子β多样性（差异）。。JSd比较样本之间所选MF特性的频率分布（即未使用强度信息），并且在计算中使用二进制对数时限制在0和1之间。例如，这些特征可以是化合物类别的相对频率或MF派生指数（如DBEAI）的分布。DBEAI是AImod的分子，在从原始MF中减去所有可能通过碳和杂原子之间的键贡献DBE的官能团后，计算为所得分子核的DBE。由于 DBEAI 以 间隔自然分箱，因此可以从样本中轻松计算每个分箱的经验概率，因此 DBEAI 优于 AImod 用于 JSd 计算并在此处使用。此外，我们发现基于DBEAI的JSd实现了更好的聚类（具有负轮廓值的样本更少）并且比基于相对峰强度的经典 Bray-Curtis 差异识别出更有意义的指示物种。 对于下面描述的Mantel测试，SPE-DOM的分子β多样性计算为9910标准化FT-ICR MS峰强度的Bray-Curtis差异性，这允许与先前使用Bray-Curtis差异的研究直接比较。将每个样品的峰强度归一化为该样品的峰强度总和。 我们注意到，任何基于MFs或峰强度的DOM分子多样性测量都低估了其真正的分子多样性，因为给定的MF或峰背后有许多异构体。然而，使用当前的分析技术，不可能得出数据集中所有MF的化学结构。MF方法是实用和保守的，可以很容易地用于计算研究中的多样性指数。
统计分析：Ⅰ基于 JSd 执行非度量多维尺度 (NMDS) 和具有平均链接凝聚聚类的层次聚类。通过最大化轮廓系数以及相异矩阵和表示组分配的二元矩阵之间的比较，找到了最佳聚类数。外部变量被事后拟合到 NMDS 排序空间，p 值计算超过 9999 个排列。使用指示物种值（IndVal）计算每个簇的MF特征，预定义组中MF的相对频率和相对平均丰度的乘积（在本例中为聚类）。当在单个聚类中找到给定的MF并且在该集群中的所有湖泊中找到MF时，该指数最大（即1）。指标值的统计显著性通过9999个排列进行了检验。针对多次测试调整每个MF的排列p值，调整后的 p 值≤ 被认为是显著的。计算每个簇的平均化学性质，包括MFs中的氮和硫含量，质量，AImod和DBEAI可以解释聚类的环境变量由条件推理树（CTree）标识（图4）。CTree 在探索变量（环境变量）的阈值处使用重复的二进制数据拆分，以便最大化聚类之间的分离。Ⅱ 我们还进行了PCA 1H NMR数据，以评估FT-ICR MS数据上的NMDS是否充分捕获了大量DOM组成差异。这一点尤其重要，因为FT-ICR MS是在相对较小的PPL提取DOM（SPE-DOM）上进行的。以 ppm 的分辨率（每个样品 780 个数据点）为每个样品导出 – ppm 的 NMR 光谱信号强度。由于大多数样品中缺乏信号，因此未包括芳香族信号区域。PCA是在将NMR数据缩放到单位方差（即相关矩阵）之后进行的，否则来自小分子的尖锐信号将主导负载。与 NMDS 中一样，环境变量是事后拟合的。Ⅲ 测试了空间距离和环境差异是否可以分别解释SPE-DOM的分子β多样性。通过Mantel检验评估了这些因素对SPE-DOM β多样性（Bray-Curtis差异）的影响。该检验比较为相同对象计算的两个相似/相异矩阵，并检验有关它们之间关系的假设。在这里，我们测试了SPE-DOM的β多样性随空间距离或环境差异而增加的假设。湖泊之间的空间距离计算为球体上湖泊之间的大圆距离，给定它们的经度和纬度。环境差异性计算为标准化（z score）环境变量的欧氏距离。Mantel 统计量 (rM) 是两个相异矩阵的条目之间的 Pearson 相关性，是在对每个矩阵中的值进行标准化之后得出的。Mantel统计量的重要性通过9999个排列进行了检验。使用贝叶斯信息准则（BIC）选择用于Mantel测试的环境变量对于beta回归模型以Bray-Curtis相异性作为响应变量，将z评分环境变量之间的欧几里得距离作为解释变量。此外，我们估计了BIC选择的环境变量对Bray-Curtis差异的部分影响。我们还以同样的方式估计了BIC选择的环境变量对α多样性的部分影响。
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